经常会看到一些论文，明明做了很多的工作，却没有发到相应档次的杂志上， 看到这类的文章，我的感觉通常是非常的痛心。对于一个科研工作者来说，每个实验都是心血，论文就像是我们的孩子。每一个做家长的都想极力的挖掘孩子身上的潜力，从而让孩子找到自己正确的位置，让孩子的才能不被埋没。那么如何才能让自己辛辛苦苦做出的论文发在对应档次的杂志上呢？

       1、文章发表前，要多查阅目标杂志的文章，从已经发表的文章去评估杂志与自己论文的创新性，工作量等是否相匹配，进而准确判断自己论文可以发表杂志的层次；

       2、在创新性，工作量相匹配的情况下，尽量优先影响力较高的杂志进行投稿；

       3、在被影响力较高的杂志拒稿后，若已经被送审，则要仔细研读审稿人的意见，看是否有可以显著提高文章的档次的意见；若被秒拒，则逐步降低投稿杂志的分值，虽然这种方法可能会比较费时间，但能有效保证自己的论文不被埋没；

       4、投稿前多向投稿经验丰富的老师同学请教，投稿也是一个技术活，不同的人投稿结果也可能会截然不同；

       5、设计实验时尽量围绕自己研究的核心进行，避免文章的结构太散。高分文章一般都是既有宽度又有深度的，但是个人认为文章的深度对发表杂志的档次起着决定性作用。

       接下来就从一篇来自多伦多大学莱斯利丹药学院的文章开始讲起“Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screens Expose Genetic Vulnerabilities and Mechanisms of Temozolomide Sensitivity in Glioblastoma Stem Cells” 发表在Cell Reports杂志， 影响因子为7.815。个人认为这篇文章的创新性，工作量等都是要远远高于这个层次的。

       首先看其创新性，这篇文章使用了比较前沿的技术-CRISPR/cas9全基因组文库筛选GSCs特异性适应度基因和TMZ耐药基因和敏感基因；结合干细胞，TMZ耐药性和敏感性， CRISPR/cas9等研究热点于一体，通过与人胎儿神经干细胞和其他来源肿瘤细胞进行对比，筛选出了GSCs特异性适应度基因，实验设计巧妙，严谨，合理，有很强的创新性。

       ❶ 胶质母细胞瘤（GBM）是成年人最常见的原发性恶性脑肿瘤。患者间和患者内的肿瘤异质性以及对治疗完全缺乏持久的反应可能是导致总体预后不佳的关键因素。替莫唑胺(TMZ)化疗是GBM治疗的最后的重大进展，但它的疗效非常有限，它可以引起肿瘤细胞额外的突变，可能最终导致疾病的进展。虽然人类GBM肿瘤样本的大规模基因组分析揭示了复杂的基因组结构，但这些变化很难与GBM生长和功能细胞特性相联系。事实上，我们需要更全面地了解这种异种癌症的生长和药物反应的分子决定因素，以确定新的潜在治疗方法，并提供可以与TMZ合作的新策略，目前TMZ已经在前期GBM治疗中得到了巩固。

       ❷ GBM的生长被认为是由一小群GBM干细胞(GSCs)驱动的，GSCs具有自我更新和产生子代的能力，并且表达更多的分化标记物和更有限的致瘤能力。最近的单细胞RNA测序(RNA-seq)方法和新鲜人GBM细胞的体内脂肪定位研究支持了这一观点，这也强调了化疗耐药致瘤亚群的存在。虽然GSC的致瘤特性在体内得到了最好的验证，但GSC培养系统已经使这些来自许多GBM样本的患者来源的细胞能够在体内进行难以实现的功能实验。重要的是，这些GSC培养物可靠地保留了患者的特异性表型和基因型特征，包括在单个克隆水平上，保留体内的致瘤能力和对分级生长行为的再现。

       ❸ CRISPR-CAS9技术的出现使得包括“细胞适应度”在内的一系列基因筛选成为可能，它允许系统地识别“核心”和“特定环境”的基本/适应基因，这些基因控制着所有细胞类型或特定细胞遗传背景下的细胞增殖。特定环境的适应度基因代表了独特的遗传弱点，这是合成致死率概念的基础，在某些情况下，可能被用于治疗。

       接着看下这篇文章的工作量，该文章中共做了18株细胞的CRISPR/cas9全基因组文库筛选，进行了6株GSCs细胞的CRISPR/cas9全基因组文库耐药性筛选和敏感性筛选，对筛选获得的各个关键基因都做了一定程度的功能性验证。就工作量来说，足以能达到发表10-20文章的层次。

       考虑到GBM中观察到的复杂的患者间异质性，需要多个适应度筛选来捕获所有患者之间共同的遗传依赖关系和GBM各基因型特有的遗传依赖关系。在这篇文章中，作者在10个低传代病人来源的GSC培养中进行了平行的全基因组CRISPR筛选，这些培养中包含了一系列典型的GBM基因组异常，与他们的原发肿瘤相匹配，以确定控制GSC生长和生存的分子回路。对两种正常的人胎儿神经干细胞培养物进行平行筛选，与假定的来源细胞进行比较，并分析GBM的特异性弱点。同时，作者对GSCs进行了化学基因组筛选，以识别调节TMZ反应性的基因，揭示治疗抗性的机制和组合治疗的策略。

壹

       作者通过8株GSCs， 8株非GSCs 和2株胎儿神经干细胞系进行CRISPR/ cas9文库筛选鉴定出了GSCs的遗传易感性。

       筛选流程如下：

       结果显示：

       1.鉴定出的适应性基因的无监督聚类揭示了GSCs与NSCs和RPE1从非CNS癌细胞中分离出来的分组，强调了这种癌症类型与来自共同神经发育谱系的细胞具有共同控制生长和生存的环境特异性机制。

       2.区分“谱系特异性”适应性基因(GSCs和NSCs共有)和在转化或肿瘤进化过程中产生的GSC特异性适应性基因

       3.GBM特异性癌症适应性基因的富集图谱揭示了一系列网络中的遗传缺陷，包括染色质组织和DNA修复、细胞命运和胶质形成、胆固醇生物合成、DNA复制和细胞周期、内质网(ER)应激和蛋白质异常修饰。

       4.将获得的GSC特异性适应性基因敲除后， 细胞的竞争细胞增殖能力会显著降低。

贰

       GSCs和NSCs有重叠但不同的控制干细胞和细胞适应度的遗传程序。

       结果显示：

       1.将筛选结果与最近报道的31个血清生长的胶质瘤细胞系和2个GSCs的筛选结果进行比较，发现适应性基因有重叠，但存在一些关键差异。

       2.将差异最大的两个基因SOX2和SOX9敲除后，GSCs细胞适应度也随之降低。NSCs的结果表明，SOX2是GSCs和NSCs之间共享的适应性基因，SOX9在GSCs中特别重要。

       3.另外一个GSC适应性基因是泛素羧基末端水解酶USP8，它以前与生长因子受体的循环有关，但在NSC的两个筛选中都没有发现。考虑到GBM中EGFR信号的普遍解除管制，我们利用了一种工程泛素变体(Ubv8)，该变体之前被认为是一种高度特异性和强效的USP8抑制剂，Ubv8的慢病毒表达导致了两种GSC细胞系中细胞活力的显著降低，而在NSC细胞系中则没有这种现象。

叁

       作者通过一系列的分析筛选，SOCS3在GBM特异性适应性得分最高，且该基因已被证明可维持NSCs的干细胞干性，因此对SOCS3敲除的GSCs细胞进行测序，研究GBM特异性适应性的调控机制。

肆

       组蛋白甲基转移酶DOT1L调节GSCs的干性和增殖。

       1．与大部分肿瘤相比，H3K79甲基转移酶DOT1L在GSC中高度表达，是7种GSC培养的适应性基因，支持GSC的基本功能。

       2. 使用EPZ-5676抑制DOT1L21天后，可以抑制GSCs的增殖，促进其细胞凋亡。

       3. EPZ-5676处理7天BT67 GSCs中神经元分化标记物(TUBB3和NEUROD1)和星形细胞分化标记物(GFAP)的基因表达增加， 细胞干性基因表达减少，细胞的成球能力降低。

       4. EPZ-5676处理会导致H3K79me2标记的广泛丢失，包括NSC关键调控基因和GBM适应度基因SOX2和OLIG2。

       5. EPZ-5676穿过血脑屏障的能力较差，因此作者在体外对两种GSC培养物进行预处理，然后进行原位移植。接受过EPZ-5676预处理的肿瘤细胞接种动物后肿瘤生长速度降低，生存时间延长。

       6. 此外，在皮下模型中，给小鼠服用EPZ-5676导致H3K79me2标记消失，并增加了与分化相关的基因的表达。

伍

       细胞应激反应通路的调节因子在GSCs中至关重要。

       1. CRISPR/cas9库筛的结果显示高水平的GBM特异性适应度基因在应激反应途径中的类泛素化修饰中也具有丰富的功能。单独敲除类泛素化相关基因后，细胞的适应性会显著降低。

       2. 敲除UFC1和UFSP2后，内质网应激相关蛋白CHOP表达上调。

陆

       TMZ治疗效果差，易发生诱变。为了提高TMZ的临床疗效，我们需要了解TMZ耐药的遗传机制，从而为制定该标准的治疗组合提供依据。作者通过用TMZ 的LD20和LD90全基因组筛选揭示了TMZ在GSCs中的敏感性机制。

       1.使用 LD90 TMZ处理转染文库的细胞后，富集到了错配修复MMR相关的核心成员， MLH1, MSH2, MSH6和PMS2四个基因， 将MLH1, MSH2敲除后，细胞的增殖力升高；

       2.为了确定GSC人群对TMZ的内在抗性机制，我们在存在TMZ亚致死剂量的情况下进行了阴性筛选(LD20)，使用 LD20 TMZ处理转染文库的细胞后，6组细胞有4组细胞显示出TMZ敏感的核心基因集。这四种培养物对应的株系表现出一定程度的TMZ敏感性，而其余两种培养物表现出TMZ耐药。

       3.GO分析和蛋白互作网络分析显示基因和蛋白网络参与多种DNA修复途径。

       4.MCM8和MCM9在本研究的多个TMZ化学基因组筛检中被认为是最热门的蛋白，它们共同形成了参与同源重组的二聚体解旋酶复合物。敲除MCM8或MCM9对未处理细胞的适应度无显著影响，但GSC对TMZ的敏感性较强，对NSCs的影响较小。

       5.低剂量TMZ处理GSCs可导致双链断裂，在表达非靶向gRNA的细胞中迅速修复，而表达靶向MCM8和MCM9的gRNAs的细胞则表现出持久的γH2AX，这是DNA修复缺陷的一个标志。

       6.大量完全未鉴定的基因也被鉴定为介导GSCs内源性TMZ耐药的基因。C17orf53和ZC3H7A分别在至少三种GSC培养基中被鉴定为hit。

       7.锌指基因ZC3H7A敲除或过表达分别导致TMZ敏感性和抗性增加。

       8.为了测定ZC3H7A的作用，我们采用亲和纯化-质谱法鉴定ZC3H7A相关蛋白。ZC3H7A的近端相互作用体被富集，参与调控翻译、mRNA处理、细胞质应激颗粒和p53介导的DNA损伤信号等生物学过程。

       9.BioID实验发现已知的应激颗粒(UBAP2L, G3BP1)和RNA处理体(CNOT complex)蛋白与ZC3H7A相互作用，因此测试了ZC3H7A是否与这两种结构的标记物共域化。亚砷酸钠处理后，ZC3H7A定位于与应激颗粒标记物G3BP1共定位的细胞质颗粒。

       最后讲一下个人感觉这篇文章可以改进的地方：

       ✦ 该篇文章涉及的内容比较多，GSCs特异性适应度基因，GSCs TMZ耐药基因和敏感基因， 总共涉及到了11个基因的功能， 但这些基因的功能都是只做了简单的表型研究，未做深入的机制研究；

       ✦ 涉及的11个基因其中会有或多或少的相互联系，但该文章均没有将其串在一起，没有形成系统的故事；

       ✦ 如果是我的话，我可能会把GSCs特异性适应度基因和GSCs TMZ耐药基因，敏感基因分成两篇文章，然后对其筛选出的基因进行深入的调控机制研究，进而绘制一张影响细胞特异性适应度，耐药性，敏感性的调控通路图。