一、研究背景

乳腺癌仍然是全世界妇女面临的一个严重威胁。据估计，2018年乳腺癌新增病例超过210万，导致62.7万女性死亡。乳腺癌的死亡率主要是由于化疗耐受和转移。给予新的靶向干预可能有助于预防肿瘤发生或侵袭性转移，从而提高晚期乳腺肿瘤患者的生存率和临床预后。虽然乳腺癌的全球基因表达模式已被广泛研究，但涉及晚期乳腺肿瘤的基因表达的转录后调控尚未被充分研究。

目前已有100多种RNA修饰的报道，其中N6-methyladenosine (m6A)修饰，是真核mRNAs中最常见的内修饰。这种修饰的失调与人类疾病，包括恶性肿瘤密切相关。并且m6A的修饰是动态可逆的，在哺乳动物中，RNA既可以在甲基化转移酶（METTL3、METTL14、WTAP）的作用下发生m6A甲基化修饰，又可以在FTO、ALKBH5等酶的作用下发生去甲基化修饰。近年来，越来越多的研究结果表明，m6A是一种关键的转录后修饰，调控mRNA和非编码RNA的多种生物学过程，如调节前体mRNA的成熟、翻译和降解。

二、研究结果

❶ RNA去甲基化酶FTO，在人类乳腺癌中表达上调

作者首先分析了分析了111例乳腺肿瘤和12例非肿瘤性乳房组织的转录组学特征，发现与正常组织相比，FTO在乳腺肿瘤中显著上调；同时，在乳腺癌三个临床阶段的DNBC组(ER−/PR−/Her2+)和晚期组(二级和三级)中，也发现FTO的上调；随后作者进一步在乳腺癌细胞系和组织中验证了RNA m6A的水平，发现在乳腺癌细胞系和乳腺肿瘤中，m6A的丰度明显下降。通过临床结果分析，发现FTO的上调与晚期乳腺癌患者和ER阴性乳腺癌患者的低生存率显著相关。这些结果提示FTO的上调可能与乳腺癌的发生发展有关。

❷ FTO显著促进乳腺癌细胞增殖、集落形成，减少细胞凋亡

接下来，为了确定FTO是否对乳腺癌细胞生长至关重要，作者在MDA-MB-231和MCF-7细胞中稳定敲降FTO，随后进行了一系列细胞功能实验。结果发现，FTO敲降后，细胞增殖和集落形成能力被抑制，细胞凋亡水平上升；同时，Mammosphere formation assay结果发现敲降FTO后，乳腺癌细胞成球能力下降。

综上所述，研究结果表明FTO在控制乳腺癌细胞生长、集落形成和细胞死亡方面起着重要的作用。

❸ 沉默FTO可抑制裸鼠乳腺肿瘤生长

接下来，作者进一步探究FTO在体内的作用。首先在4T1细胞（小鼠来源的乳腺癌细胞系）中构建了FTO敲降稳定细胞株，然后构建了皮下荷瘤模型。实验结果显示，FTO敲降的皮下肿瘤的生长明显受到抑制，同时，Rhein（FTO抑制剂）实验组小鼠也观察到肿瘤被抑制生长；随后，作者进一步在NOD/SCID小鼠中进行了原位异种移植实验，并且稳定表达荧光素酶用于活体成像，相比于对照组，FTO敲除组的小鼠几乎没有检测到肿瘤。

此外，通过尾静脉注射FTO敲降4T1细胞和对照细胞，建立肺转移瘤模型。结果显示，在FTO敲降组中，肺转移明显被抑制。以上结果表明FTO在体内促进乳腺肿瘤生长和转移中起着至关重要的作用。

❹ RNA-Seq分析发现BNIP3是FTO介导的m6A修饰的下游靶点

为了探讨FTO的分子机制及其在乳腺癌中的下游靶点，作者用FTO敲降的细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞（FTO抑制剂DMOG处理）进行了转录组测序，GEO2R分析发现，在这两个样本中有55个具有显著变化的基因重叠；KEGG进一步分析显示，抑制FTO影响的差异表达基因显著富集在细胞增殖、细胞周期和凋亡信号通路。作者进一步采用m6A-Seq来绘制MDA-MB-231细胞中m6A修饰图谱，发现大多数m6A信号在mRNAs的终止密码子附近富集。随后，作者在其中选择FoxO信号通路中的促凋亡基因BNIP3作为FTO介导的m6A修饰的候选靶点进行下一步研究；BNIP3在FTO敲降和FTO抑制的细胞株中都显著上调，且string共表达分析表明，BNIP3与凋亡基因如Bcl-2和Caspase3密切相关。

❺ FTO-m6A依赖机制对BNIP3的表观遗传学沉默

为了验证BNIP3是FTO的下游靶点，作者检测了乳腺癌细胞中BNIP3 mRNA的表达水平和蛋白的表达水平。与RNA-seq数据一致，BNIP3在FTO敲降细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞中显著上调，并且降低细胞中Bcl2的表达，促进了Caspase 3的裂解。这些结果表明，FTO通过下调BNIP3来抑制细胞凋亡。接下来，作者进一步确认BNIP3是FTO-m6A修饰的靶标，m6A MeRIP分析发现，敲降FTO显著提高了BNIP3基因的m6A水平。前面的m6A RNA-seq发现，在靠近BNIP3终止密码子的3′UTR中鉴定出3个潜在的m6A修饰位点，荧光素酶报告实验表明，位点#1是FTO对BNIP3 m6A调控的修饰位点。

❻ BNIP3是一种肿瘤抑制因子，在临床乳腺癌患者中与FTO表达呈负相关

BNIP3作为FTO的功能靶点，是细胞凋亡所必需，提示其在乳腺癌中具有抑癌作用。通过对Oncomine数据库的分析，作者发现与非肿瘤附属组织相比，BNIP3在包括乳腺癌在内的各种人类癌症中下调，且过表达BNIP3激活了Caspase3的分裂，抑制了Bcl-2的表达。对R2数据集的分析发现，BNIP3的水平与使用紫杉烷-蒽环类药物和他莫昔芬治疗的乳腺癌患者的总生存率呈正相关。同时，通过数据库(GSE9014)分析和免疫组织化学实验，在乳腺肿瘤中观察到BNIP3和FTO的表达水平呈显著负相关。此外，在4T1皮下乳腺癌模型中，作责检测到BNIP3在FTO抑制或FTO沉默肿瘤样本中上调。结论：在临床样本中，BNIP3与FTO表达呈负相关。

❼ 沉默BNIP3可显著减轻体外和体内依赖于FTO的肿瘤生长和转移抑制

为了探究BNIP3是否介导FTO依赖性肿瘤的生长和进展，作者在FTO稳定敲除乳腺癌细胞中转染靶向BNIP3的shRNAs，发现抑制BNIP3后减轻了由FTO介导的对细胞增殖的抑制作用，EDU实验进一步证明了这一结论。随后，为了验证BNIP3在体内的作用，作者将FTO-knockdown 4T1和双knockdown稳转细胞(shFTO和shBNIP3)皮下植入Balb/c小鼠，结果发现双重敲降(shFTO和shBNIP3)促进了小鼠乳腺肿瘤的生长。此外，在肺转移小鼠模型中发现，双敲除的4T1细胞的肺转移增加。结论：沉默BNIP3可以显著减轻FTO依赖的体内外肿瘤生长和转移抑制作用。

总结

m6A去甲基酶FTO在乳腺癌中的扮演着致癌角色。在FTO低表达细胞中，BNIP3 mRNA的3'UTR被m6A甲基化，BNIP3的表达上调诱导凋亡。而在FTO高表达细胞中，FTO介导BNIP3的m6A去甲基化，导致其表达下调，从而促进细胞增殖。因此，FTO-m6A-BNIP3信号通路可能成为乳腺癌治疗的潜在治疗靶标。