正在进行的COVID-19大流行已导致全球179万人死亡，在许多国家仍未得到控制，造成了紧急的全球危机，冠状病毒是一种正链RNA病毒，在人类流行的季节性冠状病毒会引起轻微的、类似普通感冒的症状。在动物中传播新型冠状病毒已突破物种屏障，造成人类感染。21世纪，三次引人注目的冠状病毒疫情暴发，表明该病毒家族具有跨物种、迅速传播并夺去无数生命。SARS-CoV-2大流行推动了冠状病毒研究。因此，迫切需要更好地理解SARS-CoV-2生物学和识别潜在治疗靶点，在冠状病毒生物学更广泛背景下获取和解释这些知识，为未来可能爆发的疫情做准备也至关重要。

2021年 2月10日，洛克菲勒大学病毒学和传染病实验室Hoffmann 课题组在Cell Host & Microbe（IF 15.923）在线发表了题为 Functional interrogation of a SARS-CoV-2 host protein interactome identifies unique and shared coronavirus host factors  的研究论文。

一、结果展示

❶ CRISPR-Cas9文库筛选SARS-CoV-2感染必需宿主蛋白

前期研究利用SARS-CoV-2的26个蛋白分别转染到KEK293T，免疫共沉淀鉴定332个互作宿主蛋白。根据筛选到的互作蛋白定制个性化CRISPR-Cas9文库，靶向332个基因，共3944条sgRNAs（含314条对照和310条参与细胞存活和增殖），进一步筛选出SARS-CoV-2感染和诱导病变的必需因子（图1A）。为了确定必需宿主因子对温度依赖的差异，作者分别在33℃和37℃条件下（模拟上呼吸道和下呼吸道），将CRISPR-Cas9文库病毒转导到Huh-7.5 肝癌细胞（表达ACE2（SARS-CoV-2细胞受体）和TMPRSS2（SARS-CoV-2进入细胞的）），经过嘌呤霉素和病毒感染筛选获得基因组DNA，通过高通量测序（图1B）及生信分析，分别获得42（33℃）和43（37℃）个候选基因显著影响SARS-CoV-2诱导的细胞死亡；其中，21（33℃）和23（37℃）个候选基因被认为是潜在的宿主因子促进SARS-CoV-2-induced细胞死亡（紫色）；然而21（33℃）和20（37℃）个是病毒生命周期拮抗剂的基因（橘色）（图1C，1D），结果表明SARS-CoV-2诱导的互作蛋白对于病毒感染或病毒诱导的细胞死亡是必不可少的。对2个温度下筛选的富集和耗竭基因取交集，分别获得不同的基因列表（图1E）。

图1 CRISPR筛选SARS-CoV-2相互作用蛋白

❷ 多种冠状病毒感染筛选宿主必需基因

同一家族的不同病毒感染可能需要共同的和特异的宿主基因参与，从功能上区分这些需求，对病毒宿主生物学有一个全面的了解；从应用角度，能够鉴定冠状病毒共同作用的靶点。研究者增加了3个冠状病毒HCoV-229E, HCoV-NL63和 HCoV-OC43 的感染筛选（图2A）。四个冠状病毒筛选获得共同的显著富集基因子集，比如Rab GTPases，HOPS 复合物的组成部分，EMC1，GPI 锚定生物合成是冠状病毒感染和诱导病变必需的宿主基因（图2B-2E）。

图2 不同冠状病毒感染筛选病毒特异和公共的宿主因子

通过siRNA分别干扰候选基因表达，检测病毒抗原(N蛋白)或者病毒复制中期的双链RNA，结果表明这些基因的一个子集是病毒复制和传播所必需的。随后研究者选择A549进一步验证，结果表明，分别敲低多个靶基因显著抑制病毒感染A549细胞，进一步证明了筛选宿主互作基因的有效性和普遍性（图3B-3C）。

图3 高度可信的SARS-CoV-2感染宿主蛋白验证

❸ 筛选互作蛋白与具有功能的互作蛋白

接下来，研究者以病毒饵蛋白为中心，将CRISPR筛选的靶蛋白绘制蛋白互作网络图（图4A）。随后探索了对于给定的诱饵蛋白，宿主靶蛋白数量是否可以预测功能相互作用的百分比，作者使用超几何检验测试了每种诱饵蛋白在功能性靶蛋白中的富集情况，结果表明Orf9c诱饵蛋白在功能性互作蛋白中被显著富集（图4B）。有趣的是，与许多宿主蛋白互作的诱饵蛋白（如Orf8，Nsp13）有相对较少的功能性互作靶蛋白；然而Nsp7，Nsp8，Orf9c诱饵蛋白有较多的功能性互作靶蛋白。假定的SARS-CoV-2相互作用332个互作蛋白中，87个靶蛋白为SARS-CoV-2感染必需的；与SARS-CoV-2相互作用的有些靶蛋白，对一种或多种其他冠状病毒感染是必要的，但对SARS-CoV-2的感染不是必要的，如DDX10, RPL36,GNG5和CYB5B （图2E-4A）。

结果表明，在功能性需要的宿主蛋白中，宿主与病毒相互作用蛋白被富集，但物理结合和功能需要之间的关系并不严格一致。

图4 CRISPR筛选的网络覆盖图

二、结论

综上所述，该研究通过CRISPR-Cas9文库（靶向332个SARS-CoV-2互作蛋白）筛选不同冠状病毒感染必需的互作蛋白和功能性蛋白，展示了不同冠状病毒感染宿主细胞在Rab GTPase和GPI锚点生物合成存在病毒特异性差异，以及参与胆固醇稳态的多种公共互作因子的鉴定,为拦截和治疗COVID-19的药物研发提供信息并为未来的冠状病毒暴发做好准备。