纽约基因中心和纽约大学等研究机构的研究人员们，利用CRISPR 筛选SARS-CoV-2的潜在治疗靶点，研究结果可能为开发有效治疗COVID-19的新型药物提供了重要见解，并揭示它们的分子靶点。

BACKGROUND

新冠病毒（SARS-CoV-2）属于冠状病毒科，具有较强的传染性和低致死性。截止2020年10月，引起的新冠肺炎（COVID-19）病例数已达4000万，死亡人数超过100万。过去20年，已经出现了三个人兽共患的冠状病毒：SARS-CoV (2002) ，MERS-CoV (2012) ，SARS-CoV-2（2019）。鉴于SARS-CoV-2已经在全球范围内对人的生命和经济造成重大损失，许多研究机构、政府和药企已经致力于开发抗病毒药物和疫苗。目前，近30种抵抗SARS-CoV-2的疫苗已经进入临床实验中；美国食品与药品管理局(FDA)批准的瑞德西韦用于新冠肺炎治疗，作为SARS-CoV-2的RNA依赖RNA聚合酶抑制剂。目前新冠肺炎的治疗主要针对病毒本身，本研究提供了宿主基因如何影响病毒进入，并为治疗提供新的途径，有望加速易感人群的康复。

RESULTS

1、高通量筛选鉴定SARS-CoV-2感染必须基因

研究者使用人的GeCKOv2文库病毒（~0.2 MOI）感染A549ACE2细胞，嘌呤霉素药筛9天，随后0.3和0.01 MOI SARS-CoV-2分别感染巴细胞，感染24h检测核衣壳（N）蛋白表达，感染6天后存活的细胞被提取DNA用于高通量测序。研究者用3种方法（Robust rankaggregation，RIGER weighted-sum and second-best rank）鉴定的富集基因高度重叠。在低剂量和高剂量组的TOP 50中，有27个相同的基因。

Fig1. 文库筛选寄NGS

2、富集基因参与病毒生命周期的多个方面且广泛表达

富集的基因分别参与病毒的吸附，内吞，纤突蛋白裂解和病毒膜融合，ER-Golgi运输，转录调控，聚集在少数蛋白复合物中，包括空泡ATP酶、逆转运复合体（Retromer）、Commander、Arp2/3和PI3K。

Fig2. Top-Ranked 基因参与病毒的生命周期

为了探索是否宿主基因丢失降低SARS-CoV-2 感染是肺组织特异性或者更广泛的表达，作者选取TOP Rank基因检测他们在12个组织中的表达，结果表明候选基因均在组织中广泛表达（Fig 3C）。

3、富集的基因参与病毒蛋白互作，也参与其他病毒的感染

Gordon et al. 分别表达带标签的SARS-CoV-2 蛋白，瞬转细胞后，pull down与宿主互作的蛋白，质谱鉴定出与病毒蛋白互作的332宿主蛋白。在CRISPR筛选中，部分排名靠前的蛋白也被报道与病毒蛋白互作（Fig 3D），如ATP6AP1 ，ATP6V1A 分别与nsp6，M蛋白互作。ATP6AP1在低MOI和高MOI组中分别排名第2和第4；RAB7A 与nsp7互作，文库筛选位于TOP 50。Samavarchi-Tehrani et al. 研究A549细胞中与SARS-CoV-2蛋白互作的宿主蛋白有22个与低MOI CRISPR 筛选的TOP 50一致。

有趣的是，SARS-CoV-2 和ZIKV感染的CRISPR细胞，筛选宿主基因在GO富集基因类别有更大的相似性。SARS-CoV-2 筛选的TOP 50基因中，若干宿主基因在流感病毒、ZIKV病毒感染中也显著富集，其中包含囊泡ATP酶质子泵（参与酸化和内体加工）。

Fig3. 富集基因参与的信号通路、组织表达情况，与病毒蛋白互作，也参与其他病毒的发病机制

4、CRSPR Knockout,RNA干扰，小分子抑制剂验证富集基因

为了验证TOP-ranked基因阻断SARS-CoV-2病毒感染，研究者挑选30个基因，分别构建KO细胞株，随后用0.1 MOI SARS CoV-2感染细胞（Cas9-perturbed A549ACE2 ），感染36h，免疫荧光检测SARS CoV-2 N蛋白，结果表明每组感染的KO细胞降低了10倍。

囊泡转运基因如RAB7A, CCDC22, 和 VPS35，其他基因如 ACE2 ，CTSL 敲除后，显著降低了SARS CoV-2病毒感染、病毒载量。在人的肝细胞Huh7.5ACE2 也观察到类似的结果。siRNA 分别抑制靶基因，SARS-CoV-2 感染的细胞也显著下降。

CRISPR 筛选的TOP-ranked基因，结合药物-基因作用数据库（DGIdb数据库）筛选出69个制药基因，研究者筛选了9个基因，是26个小分子抑制剂的主要或次要靶点（Fig.4 E）。其中有9个药物是FDA批准的，7个是不同疾病的2期和3期临床实验。小分子抑制剂和瑞德西韦中，PIK-III, Compound-19, SAR405, autophinib, ALLN, tamoxifen, and ilomastat 显著抑制了病毒的感染,病毒载量降低100倍；靶向PIK3C3 的4个抑制剂、autophinib和ALLN 组病毒载量降低1000倍。

Fig. 4 单基因验证及药物靶标筛选

5、单细胞测序鉴定胆固醇合成作为多个富集基因的调控机制

为了更好的理解每个基因KO后如何影响SARS-CoV-2感染和宿主基因缺失改变转录进程，研究者利用ECCITE-seq鉴定分子机制和抵抗病毒感染的细胞通路；研究者发现ATP6AP1, ATP6V1A,CCDC22, NPC1, PIK3C3,和RAB7A基因Knockout,产生相似的上调差异表达基因，并且导致脂质和胆固醇生物合成途径上调，这6个基因的功能缺失突变可能通过类似的机制发挥作用，即抵抗病毒介导的胆固醇合成机制。差异表达的基因中，有61个和CRISPR 筛选重叠，如在6个靶基因Knockout细胞中，胆固醇表达量显著上调。利用这一见解，作者研究了氨氯地平（amlodipine）的影响，氨氯地平处理的细胞中，病毒感染细胞数、核衣壳mRNA，噬斑形成显著降低；amlodipine处理细胞的RNA-seq显示的差异表达基因和ECCITE-seq相似，其中胆固醇生物合成途径上调。

Fig.5 单细胞转录组

6、RAB7A Knockout降低细胞表面表达ACE2， 增加内体累积ACE2

Rab7a 是一个小的GTP酶，调控囊泡运输和膜转运。RAB7A Knockout细胞表面ACE2表达显著降低。共聚焦观察发现，RAB7A Knockout导致ACE2累积在胞浆和内体，少部分位于溶酶体。

Fig.6 RAB7A Knockout降低细胞表面表达ACE2， 增加内体累积ACE2

综上所述，该研究可能为开发有效治疗COVID-19的新型药物提供了重要见解，并揭示它们的分子靶点，有望加速易感人群的康复。

参考文献：

1.Zharko Daniloski et al. Identification of required host factors for SARS-CoV-2 infection in human cells. Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.10.030.