近期，意大利的耶稣圣婴儿童医院的Angela Di Giannatale团队研究发现神经母细胞瘤来源外泌体携带miR-375，远端转移到骨髓创造有利的环境，从而促进骨转移，该研究结果发表于Journal of Extracellular Vesicles 。

01  案例文章

骨髓是神经母细胞瘤（neuroblastoma ,NB）转移的靶器官，NB侵袭骨髓的机制仍然是未知的。肿瘤微环境在肿瘤发生发展中扮演着重要作用，间充质基质细胞被认为是肿瘤间质的组成部分。与NB患者（无骨髓转移）相比，骨髓转移NB患者的骨髓间充质基质细胞（BM-MSCs）展现出较强的成骨分化潜能。骨髓转移的的NB细胞分泌的外泌体高表达miR-375，促进BM-MSCs成骨分化。临床数据显示，miR-375高表达与NB患者骨髓转移相关。结果表明，外泌体miR-375在骨髓创造一个有利的微环境从而促进肿瘤转移。miR-375作为一个新的生物标志物，也是NB患者发生骨髓转移的潜在靶标。

02  案例文章的研究内容

✦ NB 和 BM 转移患者的BM-MSCs 有较强的成骨分化潜力

分别从12个NB患者（8个骨转移，MBM-MSCs；4个无骨转移，NMBM-MSCs）和7个健康人（HC-MSCs）分离MSCs。流式分别检测MSCs标志物（CD90,CD105, CD81, CD9 ）和NB细胞表面标志物（GD2）均为阳性；造血干细胞标志物（CD34, CD45 ）和神经元标志物（CD56），为阴性。原代分离的3组MSCs群体倍增时间无差异。成骨分化和qPCR检测成骨分化相关因子（RUNX2， OSTERIX，BMP2，SPP1），MBM-MSCs 有较强的成骨分化潜能。

✦ BM转移的NB细胞来源外泌体增强HC-MSCs的成骨分化

分别从原代肿瘤细胞（IMR-32 and IGR-NB8 cells ）和BM转移的NB细胞（SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1 and IGR-N91 ）分离外泌体。IMR32 exo和SHSY5Y-derived exo分别与HC-MSCs共培养24h，共聚焦成像、qPCR检测、WB检测和成骨诱导表明，与IMR32 exo 组（原位肿瘤细胞）相比，SHSY5Y-derived exo组(骨转移来源肿瘤细胞)MSCs内化的外泌体、骨分化相关因子（RUNX2， OSTERIX，BMP2，SPP1）和钙沉积被显著提高；

✦ miR-375在BM-metastasisNB细胞来源的外泌体和MBM-MSCs中高表达

RT-qPCR分别检测7个NB细胞（IMR-32,IGR-NB8 cells,SKNSH, SHSY5Y, SKNBe2 c,LAN-1,IGR-N91 ）来源的外泌体miRNA表达。与原代肿瘤细胞来源外泌体相比，骨转移NB细胞来源外泌体中，miR-375, miR-365a-3p, miR-193b-3p, miR-18a-3p, miR-140-5p 表达上调；另外，在MBM-MSCs 或SHSY5Y-exosomes /HC-MSCs 共培养模型中，miR-375也显著上调。

靶标预测显示，YAP1 和DEPTOR 可能是miR-375 的潜在靶点，YAP1参与Hippo 信号通路，抑制RUNX2的活性（成骨细胞成熟必须的因子）。因此，作者推测NB分泌的外泌体携带miR-375到骨髓通过抑制YAP1促进成骨分化。在骨转移来源的NB 细胞中，YAP1 的mRNA和蛋白水平显著低于原位肿瘤细胞；不同肿瘤细胞来源的外泌体与HC-MSCs共培养，SH5YSY-derived exosomes 组YAP1和DEPTOR 的mRNA、蛋白水平显著降低。在MBM, NMBM- 和HCMSCs ，YAP1 的mRNA和蛋白表达在MBM-MSCs中也显著降低。

✦ MiR-375调控成骨转化因子的表达

分别构建了MiR-375过表达NMBM-MSC细胞，及MiR-375下调MBM-MSC 细胞。RT-qPCR结果表明，MiR-375过表达显著下调YAP1的mRNA和蛋白水平，然而成骨标志物SPP1 and OSTERIX 显著上调。相反的，抑制miR-375可以上调YAP1和DEPTOR 的mRNA和蛋白表达。

✦ MiR-375表达与NB患者的骨疾病相关 

为了探索MiR-375与NB患者骨髓浸润的相关性，17个HC，7个NMBM 患者和14个MBM患者的外周血来源的外泌体被收集，Q-PCR 分别检测患者及患者血清来源的外泌体，在MBM组，MiR-375的表达上调。随后27个NMBM和33个MBM患者的骨髓样本被收集， 突触素（观察NB细胞的侵袭）、miR-375 表达水平被评估；miR-375 不仅在NB细胞中表达也在成骨及骨髓的其他细胞中表达。miR-375 在NB患者的临床相关性分析显示，miR-375阳性与NB患者发生骨转移正相关。在SCID小鼠模型中，PKH26 标记的外泌体可以转移到骨髓，并且外泌体注射组miR-375表达显著升高。

总之，本研究阐明了神经母细胞瘤通过外泌体中的miR-375，促进骨髓间充质基质细胞的成骨分化。

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