Tumors attenuating the mitochondrial activity in T cells escape from PD-1 blockade therapy

今天跟大家分享日本庆应大学医学院去年3月发表在Elife上的一篇7.08分文章，探讨关于肿瘤对PD-1免疫治疗耐药的机制。

文章摘要：当前最热门的免疫治疗药物——靶向PD-1受体的抑制性抗体，其治疗原理是通过阻断癌细胞表面PD-1或PD-1配体，使T细胞重新识别和杀灭肿瘤，但是这种疗法只有不到一半的癌症患者有效。作者提出两种导致免疫治疗无效的假设：癌细胞可能通过干扰T细胞的线粒体功能，或提高癌细胞表面的MHC I类蛋白表达来逃脱PD-1阻断治疗。对此，作者在小鼠中开发了一种双侧肿瘤模型用来测试肿瘤是否释放了免疫抑制因子：一侧接种对PD-1阻断免疫治疗敏感肿瘤，另一侧接种免疫治疗不敏感肿瘤。如果不敏感的肿瘤只是躲避传代的T细胞，它的存在就不会影响其他肿瘤。但是，如果不敏感肿瘤正在释放阻止T细胞活化的分子，那么另一个肿瘤也可能对PD-1阻断治疗不敏感。通过这种动物模型，作者将不敏感的肿瘤进一步分为两组：一组只是对局部的T细胞隐藏自己，而另一组释放分子可以抑制全身的T细胞。这些抑制因子的成分尚不清楚，但进一步的实验表明它们可能通过阻断T细胞中的线粒体起作用，采用增强线粒体活性的药物可以使抗PD-1治疗不敏感的肿瘤恢复敏感性。

1. 根据免疫治疗的疗效，将肿瘤分为敏感肿瘤和不敏感肿瘤

研究者首先使用抗PD-L1单克隆抗体或Pdcd1 -/-小鼠模型，阻断PD-1信号，来确定哪些肿瘤细胞株PD L1抗体敏感/响应和不敏感/不响应（图1），MC38、GL261和MethA为敏感/响应（responsive）肿瘤，而B16、LLC、Pan02和CT26为不敏感/不响应（Unresponsive）肿瘤。

图1 C57BL / 6N和BALB / c小鼠身上测试敏感和非敏感肿瘤

由于CD8 +细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是PD-1阻断疗法期间的主要效应细胞，因此作者按照图2中所示的周期，对宿主敏感肿瘤和不敏感肿瘤的T细胞进行检测图2A。他们发现在敏感肿瘤组中，淋巴结（DLNs）中的总淋巴细胞和效应记忆性CD8 + T细胞（CD62L lowCD44high，P3）均显着增加，但在不敏感的肿瘤组在PD-1阻断后，CD8 + T细胞没有变化（图2B和C）。此外，和ctrl IgG治疗组相比，PD-1阻断治疗后，敏感肿瘤组比不敏感肿瘤组的中央记忆T细胞（CD62L高CD44高，P2门）和效应记忆T细胞（CD62L低CD44高，P3门）更多。

在敏感肿瘤组中，PD-1阻断后，CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）也增加了（图2D），Th1型细胞毒活性的T-bet和IFN-γ的表达增加（图2E和F），但在不敏感肿瘤组中则没有。在具敏感性肿瘤的组中，PD-1阻断治疗后，反映而在不敏感性肿瘤组中则没有。在另一种遗传背景（BALB / c）的小鼠中也获得了类似的结果（参见原文）。综上，根据抗肿瘤免疫治疗的疗效，将肿瘤分为敏感肿瘤和不敏感肿瘤。

图2 PD-1阻断显著增加了应答性小鼠mice with responsive中效应性CD8+ T细胞的数量和功能，但在无应答性肿瘤小鼠中却没有

2. PD-1阻断后敏感肿瘤小鼠的效应CD8 + T细胞具有更高的线粒体活性

由于CD8 + T细胞中的线粒体激活是CTL激活的标志物。因此，为了确定对PD-1阻断疗法的敏感与T细胞中的线粒体活化之间是否存在关联，我们使用Seahorse Analyzer（图2-图补编1A）。我们发现来自敏感（MC38和GL261）肿瘤宿主的DLN CD8 + T细胞具有较高的基础呼吸，最大呼吸，备用呼吸能力（SRC）和受PD-1阻断的ATP转换，这在不敏感者中未观察到（B16和LLC）荷瘤宿主（图3A）。在BALB / c背景下的小鼠中获得了相似的结果。此外，PD-1阻断疗法仅对敏感能力的荷瘤小鼠增加CD8 + TIL中线粒体超氧化物的产生（MitoSox）和细胞ROS（CellRos）（图3B和C）。因此，PD-1阻断在具有响应能力的荷瘤小鼠中CD8 + T细胞的活性增加，与线粒体的激活有正相关。

图3 PD-1阻断显著增加了应答性小鼠中CD8+ T细胞的线粒体活性，但在无应答性肿瘤中却没有

3.根据是否存在全身免疫抑制特性（SIP）对不敏感的肿瘤进行分类

为了研究全身免疫抑制不敏感性肿瘤的机制，将不敏感性和敏感肿瘤分别接种在宿主的双侧（图4A）。发现当左侧不敏感的肿瘤（LLC或Pan02）存在时，PD-1阻断疗法对右侧敏感MC38的生长抑制效率低下（图4B）。但是，当不敏感的B16位于左侧时，敏感的MC38或GL261被PD-1阻断疗法抑制，与左侧没有肿瘤的时候一样有效（图4B）。PD-1阻断疗法未抑制同一实验中左侧不敏感肿瘤的大小（参见原文）。因此，我们推测不敏感的LLC和Pan02肿瘤可能释放了免疫抑制因子，而不敏感的B16没有。

图4 不敏感的肿瘤可分为有或非全身免疫抑制肿瘤

按照相同的实验设计，我们在另一背景（BALB / c）的小鼠中进行了双边肿瘤实验，并确定CT26是SIP的不敏感性肿瘤（图4C ）。综上所述，我们将不敏感的肿瘤分为两组：有或没有全身免疫抑制特性（systemic immunosuppressive property，SIP）的肿瘤（表1）。

4.肿瘤来源的抑制性可溶性因子体内抑制T细胞的线粒体活性

继续用双侧肿瘤模型从线粒体激活的角度研究了左侧的不敏感性肿瘤释放的免疫抑制因子如何抑制右侧敏感性肿瘤的免疫应答（图5A）。如图5B所示，通过PD-1阻断，在另一侧SIP阴性B16的小鼠中，MC38一侧的DLN中淋巴细胞的绝对数量增加，而在SIP阳性LLC在另一侧时，则没有。因此，在另一侧有B16的情况下，在MC38一侧存在PD-1阻断作用，DLN CD8 + T细胞中的线粒体ROS产生、耗氧率OCR和ATP转化也得到了增强，但当SIP阳性LLC发生时，情况并非如此。接种在另一侧（图5C和D）。相比之下，PD-1阻断治疗并未改变不敏感的肿瘤侧（B16和LLC）的线粒体激活状态（图5E和F）。总之，尽管LLC和B16均不敏感，但在PD-1阻滞治疗期间可抑制全身的T细胞线粒体活化。

图5 不敏感的肿瘤的免疫抑制因子抑制体内CD8+T细胞的线粒体反应

5.免疫治疗无效的B16肿瘤诱导了局部免疫耐受

我们怀疑没有SIP的不敏感肿瘤可能无法通过获得性免疫识别。我们比较了野生型和免疫缺陷小鼠（Rag2 -/-）之间的肿瘤生长。如图所示图6A与Rag2 -/-小鼠相比，野生型小鼠的敏感肿瘤（MC38，GL261和MethA）的生长显著被抑制。相反，不敏感的肿瘤或多或少对获得性免疫不敏感（图6B）。虽然SIP阳性的不敏感性肿瘤（LLC和CT26）可以被获得性免疫发现，但SIP阴性的不敏感性肿瘤（B16）被完全忽略（表1）。可能是由于肿瘤的抗原较少和/或缺乏MHC I类表达产生的免疫耐受。甚至在受到IFN-γ刺激后，B16也不表达I类MHC，但SIP阳性肿瘤却表达了（图6C和D）。换句话说，B16通过采用局部免疫耐受而不是SIP导致不敏感。

这些数据表明在SIP阴性的肿瘤中不敏感性的机制之一是缺乏I类MHC表达，并且表明抑制因子的消除仅在具有SIP的不敏感性肿瘤中促进PD-1阻断治疗功效的增强。

图6  B16中没有MHC I类表达

6.SIP阳性肿瘤的免疫抑制性小分子的分泌

T细胞增殖：为了检查不敏感的肿瘤是否释放免疫抑制因子，在从敏感和不敏感性肿瘤细胞培养物中收集到的上清液存在的情况下，用抗（CD3 + CD28）mAb包被的珠子刺激了未成熟的CD8+ T细胞（图7A）。增殖测定（胸苷掺入和Ki67检测测定）表明，在LLC或CT26的上清液存在下，T细胞增殖受到显着抑制，而在B16，GL261或MethA的上清液存在下则没有（图7B 和 图7－图补编1A和B）。稀释上清液后恢复T细胞增殖，进一步证明了LLC上清液中可溶性因子的抑制作用（参见原文）。并且，不但部分小鼠细胞系有SIP因子阳性，而且部分人细胞系也有（参见原文）。

T细胞线粒体：此外，与B16和GL261上清液相比，LLC上清液可显着抑制线粒体的ROS和线粒体电位（图7C）。与B16和GL261相比，在LLC上清液存在下培养48小时的CD8+T细胞中，氧消耗率OCR和糖酵解——细胞外酸化率（ECAR）显着降低（图7D和E）。为了阐明这种线粒体抑制是直接抑制还是间接抑制，T细胞与LLC上清液的共培养2小时，线粒体的激活参数被立即抑制（图7F）。SIP因子可以在2小时内抑制B细胞的线粒体，显示出这种抑制作用是广谱的（图7补充图3B）。这些结果表明，从SIP阳性肿瘤中释放的免疫抑制因子可直接抑制线粒体功能。

为了了解抑制因子的分子特性：作者用热灭活处理使蛋白质成分变性，并采用了葡聚糖包被的木炭（DCC）处理来吸附培养物上清液中的小分子。如图所示图7G 和 图7－图补遗1E，LLC和CT26培养上清液的热失活并未消除其抑制活性，而使用DCC处理去除低分子量化合物则消除了其抑制活性，这表明抑制因子可能由非蛋白质小分子组成。我们进一步将上清液分为'A级组分（

7.苯扎贝特与PD-1阻断剂的组合可改善患有SIP阳性肿瘤的小鼠的存活率

作者进一步在体外验证线粒体激活药物苯扎贝特是否可以逆转SIP阳性肿瘤的免疫抑制作用。实验发现，苯扎贝特可以逆转体外LLC培养上清液中抑制因子对未成熟的CD8 + T细胞线粒体抑制，线粒体功能得到了显着恢复（图8A）。此外，体内实验对LLC荷瘤小鼠采用苯扎贝特和PD-1阻断联合治疗（图8B）可增强对LLC肿瘤的疗效（图8C）。不过联合治疗无法增强对B16肿瘤的疗效（图8C）。我们在BALB / c背景下的肿瘤中观察到了相似的结果（结果参见原文）。因此，体外和体内实验共同表明，通过线粒体活化化学物质苯扎贝特可增强SIP阳性的不敏感性肿瘤的疗效。

图8 苯扎贝特通过激活线粒体克服了对SIP阳性肿瘤的免疫抑制并提高了存活率

点评

这篇文章作者巧妙的设计双侧不同肿瘤实验，将肿瘤分为有或没有释放免疫抑制因子诱导免疫耐受的肿瘤。不过免疫抑制因子的机制探讨部分，对T细胞线粒体的抑制功能并不明显。因此针对线粒体激活功能的药物联合使用并没有明显增强疗效。