经典的中心法则是指：遗传信息从DNA传递给RNA，RNA传递至蛋白质，完成遗传信息的转录与翻译的过程。

        转录过程发生在细胞核内，主要研究DNA的修饰，转录因子与启动子之间的调控，增强子、沉默子等相关的调控过程。转录后调控主要发生在细胞质，研究RNA的剪切，修饰，互作结合等相互作用关系。

        之前小编已经介绍了在DNA层次，RNA 层次，protein蛋白层次的机制验证和探索实验方式，今天再给大家介绍文章深度机制挖掘的技术：ChIRP（RNA纯化的染色质分离技术）。

        一、技术原理

        ChIRP（Chromatin Isolation by RNA Purification）

        检测与RNA结合的基因组DNA的高通量验证与探索的方法，以生物素标记的RNA做互补探针，结合至特异性的RNA，同时捕获免疫吸附该RNA结合调控的蛋白以及染色体DNA片段。

         二、技术过程

         1. 设计待研究的RNA互补结合探针（设计Input组，阴性Lacz组，positive阳性组，奇数组，偶数组）；

         2. 体外合成或转录形成标记性的短链寡核苷酸RNA探针；

         3. 以RNA探针为诱饵，免疫吸附结合的相关蛋白（或RNA）、染色体DNA；

         4. 链霉亲和素磁珠结合获取；

         5. 纯化获取分两步：一步纯化获取结合的蛋白产物，一步纯化获取结合的染色体基因组DNA；

         6. DNA染色体片段经文库构建及高通量测序分析，在基因组水平上获取该RNA条款的下游靶基因，同时可结合Q-PCR验证结合强度；

         7. RNA结合蛋白经高效液相连用质谱分析，鉴定参与转录调控的蛋白，在蛋白水平上结合western blot 验证结合强度。

         三、技术应用

         1. 全基因范围内定位lncRNA、circRNA的结合位点，以及潜在的其他RNA、蛋白、基因组DNA；

         2. ChIRP可研究细胞内相互作用关系网络；

         3. ChIRP可同时在RNA、蛋白、DNA三者之间研究，也可以研究两两互作关系；

         4. ChIRP-RNA：可以标记互补探针捕获靶标探针结合的RNA分子（高通量测序及Q-PCR）；

         5. ChIRP-protein：可以标记互补探针捕获靶标探针结合的蛋白（质谱MS及WB）；

         6. ChIRP-DNA：可以标记互补探针捕获靶标探针结合的基因组DNA（高通量测序及Q-PCR）。

         四、案例分析

         案例1：

         Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus（IF:12.109）

        1、通过ChIRP技术获取与EIciRNAs火族结合产物：包括protein-Pol II，RNA- U1 snRNP以及染色体基因的启动子片段；

         2、文章以HDAC2蛋白作为阴性对照组，以U7结合Lsm10为阳性组，检测结合蛋白 Pol II、U1A 、 U1C 与 circRNA结合；

        3、环状RNA结合产物RNA验证以U7和5S rRNA为阴性对照，验证结合的U1snRNA；

        4、结合富集的染色体DNA进行验证检测。

        案例2：

        LINC02273 drives breast cancer metastasis by epigenetically increasing AGR2 transcription（IF：10.679）

        解析1：

            （1）作者在MDA-mb-231乳腺癌细胞总建立 LINC02273 野生型和KO细胞株；

            （2）设计奇数组与偶数组进行ChIRP实验，高通量测序获取得到的RNA序列；

            （3）寻找野生型和KO细胞株测序寻找差异表达基因；

            （4）野生型和KO组测序的差异表达基因与ChIRP测序获取的信息进行寻找潜在的靶标分子。

         解析2：

         分析在染色体基因组野生型和KO组，以及经过ChIRP纯化获取的DNA信息，寻找靶标染色体DNA。

         结语：对于分子机制的深度挖掘，以多维度结合，在全细胞层次探究潜在的分子机制，提高文章研究深度。