分子机制已经是发表完文章必不可少的一环实验，下面给大家详细介绍一款，如何在蛋白层次挖掘机制？CO-IP（蛋白互作免疫共沉淀）。

CO-IP是用于检测或探究蛋白与蛋白之间相互作用的实验，属于IP实验的扩展，在样品溶液中，捕获和纯化通过天然相互作用及靶标结合的其他大分子蛋白，基于抗原抗体的特异性免疫结合，以饵蛋白为诱饵蛋白，通过饵蛋白抗体捕获，磁珠吸附结合，进而将饵蛋白结合的互作蛋白捕获得到，纯化定量定性分析。

具体操作步骤：

1、准备样本

样品分为组织和细胞两种，是最常见的，组织就用液氮研磨，研磨时候，少量多次加入液氮，记得研磨时用研磨杵按住组织旋转研碎，戴个护目镜或是头盔，知道为什么？因为不戴护目镜可能会瞎，不戴头盔，可能会毁容。细胞就简单了，直接消化下来离心，预冷1XPBS清洗1-2次，有人说，消化会对细胞有影响，不入细胞刮子刮下来好，其实两种想法都可以，消化是影响细胞膜表面蛋白构象，尤其是层黏连蛋白和粘附蛋白改变，导致细胞贴壁不牢，进而脱落，对细胞内蛋白影响几乎没有，细胞刮子刮下来也行，虽然存在物理机械损伤，但损伤相对来说，可忽略，两种方法相较来说，细胞刮操作，物理影响会小些。

2、细胞裂解

这步很关键，记住要使用弱裂解液，不要直接用WB裂解蛋白的裂解液，我们要做免疫共沉淀，要保留细胞内天然构建结合，强裂解液把蛋白都变性了，不能用强，要弱，弱性裂解液在于表面活性剂，比如NP-40、Triton X-100都不错。

3、磁珠清洗及抗体孵育

这步正常操作，磁珠用之前摇一摇，按照使用量吸取，不要用小枪头，用1ml大枪头，且是无菌无酶，加入适量抗体与buffer，混入磁珠即可，对了，磁珠人员黏连到移液枪头，放入溶液中反复吹打几次就好。

4、磁珠-抗体-裂解液孵育

核心步骤在这步，磁珠与抗体孵育完成后，请buffer清洗3次，再加裂解液，有人说，为什么要清洗，还洗三次？这么问的，最后都被老板骂了......为什么要清洗：去除未结合至磁珠表面的游离抗体，防止游离未结合的抗体结合到饵蛋白，降低结合总量。为什么洗三次？许多前辈和各种科研公司发现，清洗低于三次，残留量比较大，清洗三次，残留低于10%左右，清洗次数高于三次，结合至磁珠上的抗体，产生损失，综合起来，三次最佳。磁珠-抗体复合物清洗完，加裂解液孵育，注意了，要颠转孵育，不能静置，磁珠是固体，溶液沉降，颠转孵育，不但能使磁珠不沉降，而且使磁珠-抗体与蛋白结合更充分全面。放置4℃，颠转过夜。

5、清洗纯化磁珠-抗体-蛋白复合物

这步就关键了，这步要清洗6次，清洗少了，假阳性，清洗次数多了，结合蛋白损失就大了，至于为什么要洗6次，前辈们做实验验证出来的，发现6次是最佳的，清洗的时候，要用两种buffer，一种低盐，一种高盐，尽量去除未结合的蛋白，防止假阳性出现。

6、检测

检测就分为三种，根据实验目的来。一种是银染：按照input组、目的组、IgG组、beads组跑胶银染，查看蛋白差异性；一种是WB检测：根据预测结合的靶蛋白，进行WB检测，看有无条带，确认是否结合（要做内参）；一种是MS（质谱）检测：质谱检测是根据产物蛋白，进行酶解消化成多肽，再测定多肽，获取序列，比对蛋白数据库，查看潜在结合蛋白有哪些，探讨结合蛋白。

综上完成，这个实验就结束了。最后通过案例分析，给大家提供一些文章思路。

文章思路

已有靶标分子DDX17，通过生物性学TCGA数据库和免疫组化（IHC）验证在肝癌病理中是一个重要的靶标蛋白，且是转录调控因子；

细胞水平：肝癌细胞系SMMC7721、HEPG-2细胞中，通过过表达和敲低DDX17，探讨细胞的表型变化，迁移和侵袭；

分子机制：蛋白水平调控，CO-IP连用GST-pull down，调取与之互补结合的靶蛋白KLF4；

深度机制挖掘：蛋白调控水平是通过结合的锌指结构域，破坏锌指结构域之后，不能引起结合和调控，与EMT（上皮-间充质转化）相关基因失去调控作用。

详细图解：

TCGA+IHC验证靶标分子DDX17是肝癌发生过程中重要分子

DDX17与肝癌的迁移和侵袭相关

CO-IP联用GST-pull down技术，寻找与DDX17结合的互作蛋白KLF4

深度挖掘，获取结合位点为锌指结构域