一、背景

间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是来源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，同时还具有独特的免疫调节能力。由于这些特点，间充质干细胞被广泛用于细胞治疗和再生医学的研究。

间充质干细胞来源广泛，除了最初的发现骨髓以外，人们陆续从脐带、脐带血、脂肪、牙髓、羊水、羊膜、胎盘等组织分离出MSCs，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，相比间充质干细胞的传统来源骨髓而言，脐带间充质干细胞具有取材方便，无创，含量丰富，易于分离培养，体外扩增迅速且生物性能稳定，免疫原性较低且更为原始等特点，被认为是替代骨髓间充质干细胞的理想来源，具有广阔的临床应用前景。

二、常见分离方法

目前所使用的hUCMSCs分离培养方法主要有组织块贴壁法和酶消化法两种，也有研宄者综合使用这两种方法。酶消化法常使用胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶中的一种或几种处理剪碎的脐带组织，在短时间内可以获得hUCMSCs，但大量研究发现，组织块贴壁法虽然花费时间更多，但所得到的hUCMSCs质量远比酶消化法高很多，因此本文将向大家介绍用组织贴壁法进行hUCMSCs的原代分离。

三、实验材料准备

正常足月分娩的健康婴儿脐带组织、手术器械、培养瓶/皿、青霉素100 U/mL、链霉素100 ug/mL、MSC nutriStem® XF Basal Mediun（BI）、MSC nutriStem® XF supplement(BI)、干细胞温和消化酶、超净工作台、磷酸缓冲液、37℃、5%CO2饱和90%湿度的培养箱等。

四、实验步骤

1、取新生儿脐带，在超净工作台中用镊子将脐带放入50ml离心管中，2%青链霉素混合液的 PBS 缓冲液，震荡离心管，重复清洗三遍，尽量弃除残留的血液；

2、将脐带完全浸入75%酒精溶液中消毒，并迅速取出，加入2%青链霉素混合液的 PBS 缓冲液清洗三遍，弃除残留的乙醇；

3、将脐带转移至 15cm 培养皿中，用手术到将脐带组织剪成3-5cm大小的小段（图1），剥离脐带中的脐静脉和脐动脉（如图2）；反复用含 2%青链霉素混合液的 PBS 缓冲液漂洗脐带，直至漂洗液中无血水；

图1                                                                                                                                 图2

4、持续观察，待细胞汇合度达到80%即可进行传代，用组织贴壁法分离细胞，一般在一周左右可以观察到细胞爬出来，细胞汇合度达到80%通常需要两周以上，细胞爬出来的快慢与脐带的质量也有一定的关系；

5、细胞培养：本培养基配方为无血清体系，因此在传代时不能用胰酶，需要用到温和的消化酶，取汇合度达到80%以上的细胞，吸弃原培养基，加入PBS清洗两遍，吸弃PBS加入1mL的温和消化酶，在镜下观察大部分细胞回缩、变圆甚至漂起，时间大约2min，加入5倍胰酶体积的PBS将细胞吹打下来，转移至离心管中1000rpm离心5min，弃上清后加入PBS离心洗一遍，加入培养基吹打成单个细胞悬液，按照1：2-1：4进行传代培养。

小贴士

在使用组织块贴壁法做动物细胞原代培养时，有两个比较关键的条件限制： ①组织块具有足够多的锋利切口；②组织块紧贴塑料培养皿底部。只有同时满足以上两点，才会有细胞从贴壁的组织块周围长出。所以，使用该种方法进行组织块贴壁时，首先要将组织剪碎成细小的肉糜状，以形成大量的锋利切口，然后接种至培养皿底部进行贴壁培养。

五、实验结果

分离后第五天观察到少量细胞从组织中爬出

分离后第十五天细胞汇合度达到80%以上（左：40X、中100X、右200X）