小编搜了个25分多的文章来给大家讲讲CRISPR文库筛选耐药基因的思路，由剑桥大学、英国Ralph Lauren乳腺癌研究中心、挪威科技大学和京都大学4家单位共同研究，2020年2月发表在Nature genetics上。

1、文章背景

四分之三的乳腺癌是由雌激素受体（ER，estrogen receptor）调控下诱发，靶向ER通路的药物对大部分ER+疾病妇女有效，但是相当多的女性治疗无效或后期耐药。耐药机制的研究集中在寻找影响ER转录活性的染色质重塑复合物SWI / SNF（最先在酵母中发现这些染色质重塑复合物会导致交配型转换/蔗糖不发酵SWItch mating type/Sucrose Non-Fermenting的表型，简称SWI/SNF）。已经发现有三类常见的SWI / SNF复合物-染色质重塑复合物：BAF(BRG-/BRM-associated factor)、P-BAF和非经典BAF（ncBAF），以及这三类SWI / SNF复合物的核心亚基：BAF（ARID1A，ARID1B，DPF1 / 2/3，SS18）、P-BAF（ARID2，PBRM1，BRD7）和ncBAF（BRD9，GLTSCR1，GLTSCR1L）。为了系统地鉴定与乳腺癌的治疗反应有关的基因功能，研究者采用了全基因组CRISPR文库筛选方法，结合三种不同的治疗方式（两组雌激素受体拮抗剂药物和一组BETi药物），揭示了SWI / SNF复合体是雌激素受体拮抗剂疗效的决定因素。

2、CRISPR筛选显示ARID1A是关键基因

研究者首先构建了全基因组CRISPR筛选文库18,009个人类基因敲除（knock out，KO）的MCF-7乳腺癌细胞，20d时间雌激素受体阻断剂筛选富集耐药的CRISPR的KO库细胞。研究者假定含溴结构域的蛋白质4（BRD4）是ER + 乳腺癌的治疗靶标，用组蛋白乙酰化阅读器靶向含溴结构域和末端外域的抑制剂（BETi，Bromo and extra-C terminal domain inhibitor）作为验证该耐药机制通路的药物，用验证药物同时做CRISPR的KO文库筛选。散点图显示在经过雌激素受体阻断剂筛选26天以后，4个BAF蛋白相关基因比DMSO处理的对照组更多（补充图1）。图1a~c在经过雌激素受体拮抗剂药物筛选26天以后，BAF, P-BAF和ncBAF相关的 sgRNA富集或耗竭情况。图1d~f表明两组ER靶向药物筛选出来的sgRNA基因非常相似，而BET靶向药物（JQ1）筛选出来的sgRNA有明显不同。

氟维司群（Fulvestrant，雌激素受体拮抗剂， 可通过诱导雌激素受体降解，阻断雌激素受体。

图1a~c Log2差异倍数热图（a）丰度迅速增加的sgRNA：包含已知的ER通路基因；（b）丰度缓慢减少的sgRNA；（c）丰度缓慢增加的sgRNA：包含抑制肿瘤生长的基因。

d，层次聚类热图表示感染的第3-20天与增殖有关的sgRNA丰度减少更明显，时间越久，减少越多； 

e，层次聚类热图，与DMSO治疗（感染D9后的DMSO对照）相比，两种雌激素阻断剂（氟维司群（Fulv，从300 nM开始并逐渐减少至100 nM），100 nM 4-羟基他莫昔芬（Tamox）或抗癌药BETi（JQ1， 1 µM减少至250 nm）处理26天后基因的log 2倍变化。

f， ARID1A（富含AT的相互作用域1A）和其他BAF的sgRNA在雌激素阻断剂的治疗下，明显富集（数值是这些基因的sgRNA水平相对于DMSO的倍数）；而相反的是，在抗癌药BETi治疗下，ARID1A sgRNA丰度明显减少。BAF亚基的ARID1A，ARID1B，SMARCB1和SS18基因的sg丰度在Tamox和JQ1两种药物条件下明显相反。

从上面的文库筛选出来的基因中，研究者挑选出在两组ER靶向药物中丰度最高、在BET靶向药物丰度最低的ARID1A继续展开实验。在MCF-7和ZR-75-1细胞中验证了由ER靶向拮抗剂介导的抑癌作用具有ARID1A依赖性。（雌激素受体拮抗剂处理条件下，si ARID1A的细胞生长更快；BETi处理条件下，siARID1A的细胞生长没有差异）（扩展数据图1）

由于siARID1A的细胞增殖能力显著上升，研究者继续构建MCF-7两个单克隆敲除 ARID1A细胞株（克隆11和14）。通过基于Sanger测序证实了ARID1A敲除成功（图2a，补充图4和源数据图2）。

图2a                                                      补充图4 

源数据图2

为了排除是脱靶效应导致的细胞增殖变化，研究者用敲除克隆和WT对照的体外生长验证了CRISPR筛选结果，两个ARID1A敲除的细胞克隆增殖能力变强，并且对他莫昔芬有耐药性，但对JQ1表现出敏感性，另外两种临床相关的BET抑制剂（OTX015和IBET762）同样能抑制肿瘤增殖。（图2b和补充图5）。

研究者继续做体内实验验证ARID1A敲除克隆促进肿瘤生长，用WT（野生型）、两个ARID1A敲除克隆构建皮下移植肿瘤，持续饲喂雌激素，维持ER +  肿瘤的生长，随后用溶剂或4-羟基他莫昔芬治疗。在4-羟基他莫昔芬治疗下，两个ARID1A敲除的肿瘤比野生型更大（补充图5），这证明抗雌激素必须依赖ARID1A才能发挥功效。然而，在未经治疗的条件下，在ARID1A 敲除的肿瘤明显比WT更大（图2c和补充图5）。），研究者推测他莫昔芬在ARID1A- null肿瘤中的疗效下降可能仅是由于肿瘤增殖能力的增加所致。

3、ARID1A调节ER靶基因，并且是ER复合体的一部分：RNA-seq 表达谱分析

为了探索ARID1A在药物机制中的作用，研究者使用溶剂，氟维司坦，4-羟基他莫昔芬或BETi（JQ1）处理的WT或ARID1A敲除系的四个生物细胞培养样品进行了RNA测序（RNA-seq ），对ARID1A敲除克隆和对照的基因表达分析。不管它们是亲代细胞还是WT克隆系，对照系看起来都相似（补充图8）。

补充图8                                                     图2d

氟维司群和他莫昔芬显示相似的基因表达模式，而JQ1处理则导致基因表达谱有显着差异（图2d和补充图8）。但是JQ1处理ARID1A敲除和野生型的表达谱一样。而在ARID1A敲除细胞中，被氟维司群和他莫昔芬抑制的大多数基因要么上调要么不变（图2d）。总的来说，被氟维司群和他莫昔芬阻抑的86％的基因在ARID1A敲除细胞中不再被显着阻抑，它们（图2d中突出显示）被JQ1处理显着下调至程度与WT细胞相同。因此，即使在没有ER拮抗剂的情况下，ARID1A缺失也导致诱导氟维司群/他莫昔芬抑制的基因的诱导上调，这暗示了ARID1A介导的对ER通路基因的抑制。

研究者用乳腺癌国际联合会（M的ETABRIC）队列研究中ER +  乳腺癌患者数据验证，在溶剂和抗雌激素条件下，ARID1A抑制的基因（在ARID1A基因敲除细胞系中被上调的基因）与在患者中被上调时的不良临床结果相关（图2e和补充图6），再次证明了ARID1A是耐药基因。

图2e

4、ARID1A有助于HDAC1的募集和乙酰化的调节

研究者通过快速沉淀染内源性蛋白的免疫共沉淀技术（RIME），发现在未经治疗的条件下，组蛋白脱乙酰基酶蛋白HDAC1是与ARID1A相互作用的蛋白（图3a）。

图3a

ARID1A的减少会导致HDAC1结合减少，组蛋白4乙酰化的增加以及在与ER靶向药物在WT环境中通常抑制的基因相邻的调控元件处同时发生BRD4募集（补充图14a），最终导致BET依赖性的肿瘤增殖。

补充图14a

临床结果进一步验证，具有ARID1A突变的乳腺癌患者与具有WT ARID1A的乳腺癌患者显示具有 ARID1A突变型肿瘤的妇女的临床结果较差（图 6d和补充图 14b）。

补充图14：ARID1A突变患者呈现ARID1A  阴性  图 6d：ARID1A突变患者生存期更短

取ARID1A 突变女性的PDX肿瘤组织离体培养，经过BETi处理48 h，研究者观察到了增殖指标Ki67的表达减少，说明具有显着的抗肿瘤增殖作用（图6e，f），证实了ARID1A 突变体/缺失型和WT都依赖BET蛋白才能增殖。也提示BETi具有潜在的抗癌药物价值。（比较可惜的是，研究者没有用JQ1治疗解除耐药的实验证据。）

图6e和f

为了进一步验证ARID1A调控细胞增殖的耐药机制，研究者进行了一系列蛋白质组学方法：包括ChIP-seq实验，内源性相互作用的快速免疫沉淀质谱法（RIME），来鉴定ARID1A，BRG1或ER的相互作用，发现ARID1A和两个SWI / SNF常见蛋白BRG1和SNF5（BAF47）的结合位点。SWI / SNF复合物通过先驱因子FOXA1主动结合ER之前被募集到ER 顺式调控元件。ARID1A通过募集HDAC1表现出转录抑制作用，并且当ARID1A功能失活时，会导致HDAC1组蛋白脱乙酰基酶1结合减弱，BRD4组蛋白4赖氨酸乙酰化结合的增加，以及随后的BRD4驱动的转录和肿瘤增殖（图6g）。感兴趣的小伙伴可以查看原文。

图6g

最后总结一下研究者的思路：首先用全基因组CRISPR文库筛选雌激素受体阻断剂氟维司群和他莫昔芬的耐药靶点。其次用验证耐药靶点的抑制剂BETi（具有潜在的抗癌药物价值）同时做CRISPR文库筛选，筛选出雌激素受体阻断剂中sgRNA高丰度并且BETi筛选下低丰度的ARID1A 和其他3个SWI / SNF复合物亚基是最关键的耐药靶点。接着验证ARID1A失活会导致ER阻断剂抗癌药失效。并用一系列的ChIP-seq实验验证ARID1A和SWI / SNF复合物亚基的转录调控活性。最后用临床证据说明ARID1A突变患者预后更差，针对ARID1A突变患者，可以通过抑制BET通路来减少耐药。

好了，

今天就先解读到这里吧，

祝大家早日发高分文章